水溶性Cy5.5菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是zui高的，其琥珀酰亚胺 酯是zui常用的脂 肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。

CyDye mono-reactive NHS Esters (菁染料琥珀酰亚胺酯)

1.产品简介：

 菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是zui高的，其琥珀酰亚胺 酯是zui常用的脂 肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。 通过改变次甲基链的长度，可改 变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照 Huoffman 规则正 好红移约 100nm。 菁染料 Cy3 和 Cy5 已成为基因芯片的首xuan荧光标记物；另外,Cy5, Cy5.5 和 Cy7 的吸收在近红外区背 景非常 低，是荧光强度最高、zui稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。但 由于菁染 料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。菁染料 特别是水溶性菁 染料分子极性大，分离提纯越加困难。

表 1.菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数

2. 操作步骤

2.1 水溶性 Cy3 NHS 标记 anti-GST 多克隆抗体

市场上买到的抗体如果含有其它蛋白(例如 serum albumin 或 gelatin 等)或带氨基的缓冲液会影响标记, 在标记前需纯化。

1.在 1 L 0.15 M NaCI 溶液中透析 anti-GST 抗体(浓度为 0.5 mL at 3 mg/mL),常温透析 4 小时。

2.在 4°C 用新鲜的 1 L 0.15 M NaCI 溶液再透析过夜。

3. 第二天用 1 L 0.1 M NaHCOs (pH 8.3)透析 4 小时。

4. 用 0.22 卩 m 注射器过滤头过滤抗体溶液。

5.用 0.1 M NaHCOs 稀释少量的抗体，在 280nm 处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量(IgG antibody 摩尔 吸光系数 170 000 cm" at 280 nm).

6.用 DMS。配置 Cy3 NHS (MW 765.95)溶液浓度为 10 mg/mL；计算所需体积以得到想要的 CyDye NHS 和抗体的比值(例如 20:1),然后慢慢'寿其入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅 拌 45 分钟。

7.用 1 L 0.15 M NaCI 溶液常温避光透析 4 小时除去未标记上的 Cy3。

8.在 4°C 用新鲜的 1 L 0.15 M NaCI 溶液再避光透析过夜。

9.用 1 L of 0.01 M PBS/ 0.01%叠dan化na溶液常温避光透析 4 小时，在 4°C 常温避光再次透析 过夜。

10.用 0.22 卩 m 注射器过滤头过滤抗体溶液。

11.用 0.01 M PBS/0.01 %叠dan化na数倍稀释标记抗体溶液，测量 280nm (蛋白)和 552nm (Cy) 处的紫 外可见吸光度。

12,产品冷冻干燥成粉末或在 0.01 M PBS/ 0.01%叠dan化na溶液中，-20°C 避光储存。

2.2 水溶性 Cy5 NHS 标记

1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于 400 pL DMS。后，加入到 1mL 的玻璃瓶中盛有 (D-seQ-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg)的 400 pL DMS。溶液。(Dye 和 peptide 投料比是 1:1)

2. 然后加入 15 卩 L 三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。

3. 用 HPLC 纯化蛋白，使用蛋白 C18 柱子(25cmx10mm),每次上样注入 2x400 卩 L, 30 分钟 梯度洗脱从 0.1% TFA 水溶液到 MeCN：HQ (0.1% TFA) =70：30,流速 4mL/min°(对不同的 蛋白选择不同的合 适 HPL C 梯度流动相)

4. 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。

5. 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20°C 避光储存；必要肘可用质谱表征。

6. CyDye 标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的 IgG 在 4 °C 可避光保存 2 月；更长 期的保存需加入等 体积的甘油-20 °C 避光保存。

2.3 水溶性 CyDye SE 标记

      氨基封端的 OLIGO 可以标记 CyDyeSE,但是非常困难；标记前因为 OILGO 经氨水脱保护， 请务必洗涤掉 所有的残余氨水。然后将样品真空干燥；然后溶于 0.25 ml 的 0.5 M NaCI 溶液 中，用 Sephadex G-50 脱 盐，用 5.0 mM borate 缓冲液平衡到 pH=8.0,然后用以上硼酸缓冲液 冲下 OLIGO。然后浓缩至干的样品溶于 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在 0.5mL 碳酸 缓冲液中 30 nmoles 的。LIGO 加入到 CyDye SE 的玻璃 瓶中室温避光，密闭搅拌反应 60min。 反应物经 Sephadex G-50 或 RP-HPLC 过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides 和 oligopeptides 由于太小会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜，无法标记。

2.4 活体成像领域

SPF 级 BALB/C 裸鼠，6-8 周龄，18-20 克，实验前 24 h 自由进食、饮水。

于实验裸鼠腹腔内注射 2%戊巴bi妥钠 300^(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活 体成像系统的记录暗箱中。实验时将 Cy7 或 Cy7 标记的生物分子或药物 DMSO 稀释后，于裸鼠尾静脉注射 200pL( 0.5 mg/g)［最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药 物试剂等条件优化］，每 5min 记录 1 张动物 在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分 布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速 解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾 等脏器，进行成像。

Cy7 检测时激发波长 700〜770 nm 带通，发射波长 790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描 范围 780〜950 nm，扫描步进 10 nm。曝光时间为 500 ms。

不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐歩向膀胱聚集， 呈现显著的肾 排泄的特点一般 4~6 小时，快得只有 30 分钟；如果是骨骼等部位靶寻的 Cy7 标 记药物，有客户反映一周后 活体成像系统仍能检测到荧光成像。

器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于 4%多聚甲醪也不 4 小时以上，0%, 20%, 30%PBS 蔗糖依次 沉底，20 卩 m 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，B 応干，DAP'染色。共聚焦 显微镜观察，激光器为氨氤 633 nm。

稳定性与储存：

未幵封的粉末在避光干燥-20°C 存放 12 月。CyDye NHS 水溶液现配现用不能储存。任何 溶解后的 CyDye NHS 粉末最好立即使用；无水 h；DMSO 瞥/- 20°C 保存最多 2 个星期。

相关产品 Cy 系列：