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Product Center品牌 | LABLEAD | 货号 | EM001 |
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规格 | 100T | 供货周期 | 现货 |
EMSA/Gel-Shift 试剂盒化学发光法
货号:EM001
存储条件:1-4组分-20℃保存,其他组分可4ºC保存,一年有效。
产品组分
货号 | 组分名称 | 规格 | Sample |
EM001-1 | EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液 (5X) | 200 μL | 20 μL |
EM001-2 | 上样缓冲液 (无色, 10X) | 200 μL | 20 μL |
EM001-3 | 上样缓冲液 (蓝色, 10X) | 200 μL | 20 μL |
EM001-4 | Streptavidin-HRP 偶联物 | 100 μL | 10 μL |
EM001-5 | 洗涤液 (5X) | 250 mL | 25 mL |
EM001-6 | 检测平衡液 | 250 mL | 25 mL |
E1070-A | ECL 发光液 A | 50 mL | 5 mL |
E1070-B | ECL 发光液 B | 50 mL | 5 mL |
P1203 | 无蛋白封闭液 | 380 mL | 50 mL |
产品简介:
本试剂盒基于电泳迁移率变动实验(EMSA/Gel-Shift),结合化学发光检测技术,用于快速、高灵敏度地检测蛋白质与核酸(DNA/RNA)的特异性相互作用,如转录因子、核酸结合蛋白等的结合活性分析。试剂盒包含EMSA检测所需要的结合缓冲液,适用于基础研究、药物筛选及分子机制研究。
自备试剂
1. 探针
2. 提取用蛋白裂解液
3. 蛋白酶抑制剂
4. 带正电荷的尼龙膜或NC膜
5. EMSA电泳相关试剂
EMSA/Gel-Shift 试剂盒化学发光法
操作步骤(供参考):
1. 样品制备
(1)蛋白提取
a. 细胞样本:
收集1x107细胞,加入1ml 1xPBS洗涤一次,1000rpm离心5 min 去除上清,收集细胞;加入预冷裂解液1ml,同时按比例添加蛋白酶抑制剂,重悬细胞,剧烈涡旋10秒充分混匀,置于冰上30分钟,可每10分钟充分吹打一次;4℃,12000-16000g离心15分钟,将裂解产物(上清)转移到一个新的预冷管中,丢弃沉淀。
b. 动物组织:
将0.1g的组织切成非常细小的碎片,在冰浴条件下充分匀浆,用100um的细胞筛等收集细胞悬液,可加1xPBS冲洗;
4℃,1500g离心5min,弃上清收集细胞沉淀;沉淀中添加预冷的裂解液200ul(需添加蛋白酶抑制剂)可额外添加10ul DTT,重悬细胞后,剧烈涡旋10秒充分混匀,置于冰上30分钟,可每10分钟充分吹打一次;
4℃,12000-16000g离心15分钟,将裂解产物(上清)转移到一个新的预冷管中,丢弃沉淀。
c. 植物组织和不易匀浆的动物组织:
去植物样本约0.2g,液氮研磨;加入500-1000ul 预冷的裂解液(添加蛋白酶抑制剂)进行裂解,为了提高裂解效率,可加入 200ul 玻璃粉(可选)按照600-800g离心力充分震荡 30min,裂解完成后 12000 rpm,离心30min,吸取上清置于新的离心管中,弃去沉淀。
d. 原核/真核表达蛋白:
诱导蛋白表达并鉴定表达形式,要求表达的蛋白为上清表达;纯化诱导表达的蛋白;
e. 考马斯亮蓝或BCA测定蛋白样本浓度;
f. 样本分装为约40ul/管,保证每管含有5-25ug蛋白,液氮速冻后-80℃保存。
注意:避免反复冻融蛋白,分装保存于 -80°C。
(2) 探针标记
使用生wu素或荧光标记的 DNA/RNA 探针。
注意:探针需退火形成双链,避免核酸酶污染。
2. 结合反应
(1) 反应体系配制
根据以下表格配置不同组别的EMSA反应:
组分 | 实验组 | 阴性对照 | 野生型冷探针对照 | 突变型冷探针对照 | Super-shift | 终浓度 |
结合缓冲液 (5X) | 2 μL | 2 μL | 2 μL | 2 μL | 2 μL | 1x |
核蛋白提取物或纯化后的转录因子 | 1-5 μL | - | 1-5 μL | 1-5 μL | 1-5 μL | 5-25μg |
生wu素 标记探针 | 1 μL | 1 μL | 1 μL | 1 μL | 1 μL | 20 fmol |
竞争性探针(野生) | - | - | - | 50-200x | - | 1-4pmol |
竞争性探针(突变) | - | - | 50-200x | - | - | 1-4pmol |
目的蛋白 抗体 | - | - | - | - | 0.5-1 μL | 0.5-1ug |
ddH2O | Up to 10 μL |
(2) 反应条件
按照以上顺序添加各试剂,加入未标记的探针或者抗体后混匀,并在PCR仪上37℃反应20min,让冷探针和抗体优先反应;
加入标记好的探针混匀,在PCR仪上37℃反应20min。
注:a.避免剧烈震荡,防止复合物解离。
b.如需做super-shift反应需自备抗体
c.若蛋白为原核表达,经纯化后每个反应体系终含量为:25ng-75ng
d.竞争性探针野生型和突变型的使用量均为生wu素标记探针的50-200倍
3. DNA-EMSA非变性凝胶电泳配置
(1) 按照以下比例配置5% 非变性 PAGE 胶,总体积10ml(可按比例扩大)
组分 | 体积 |
5X TBE 缓冲液 | 1 ml |
ddH2O | 6.5 ml |
40% Acr/Bis(39:1) | 1.25 ml |
20% 甘油 | 1.25 ml |
10% APS | 75 μL |
TEMED | 5 μL |
依照上述次序依次加入各溶液,添加TEMED茜需混匀,添加TEMED后需要立即混匀并灌胶。灌胶时避免气泡并添加梳齿。
注:如发现制胶时很容易出现气泡,怎可对制胶玻璃板进行硅烷化处理。
(2) 上样与电泳
每孔加入 1 μL 10X 上样缓冲液(无色) 混合样品后进行上扬。
注:有些样品会受溴酚蓝影响,建议尽量使用无色的上样缓冲液
上样时在多余的上样孔中加入10ul稀释后的1x上样缓冲液 (蓝色)用于观察电泳进行的情况。
电泳条件:
电压:100 V(恒压),建议按照10V/cm进行电泳
缓冲液:0.5X TBE缓冲液
时间:电泳至溴酚蓝迁移至距离胶底部1/4处。
注:低温电泳(4°C)可减少复合物解离,建议在电泳过程中观察电泳温度,确保温度不超过30℃,如果温度升高需要适当降低电泳电压;
4. 转膜与检测
(1) 转膜(尼龙膜/硝酸纤维素膜)
a. 取一张和EMSA胶大小相近的尼龙膜或NC膜,剪刀剪角做好标记,用0.5X TBE buffer浸泡10min以上;
注:尼龙膜或者NC膜请勿用手接触,全程用镊子夹取,且不能接触样品位置
b. 取2张转印用滤纸,用0.5X TBE buffer 浸泡,滤纸大小与上面转印膜的大小相近或者略大
c. 将浸泡过的膜置于浸湿的滤纸上,小心的取出EMSA胶放置于膜上;
d. 建议用湿转的方式进行转膜,转膜条件:100 mA 恒流(或约390mA),4°C 转膜约60 min(缓冲液:0.5X TBE)。
e. 转膜结束后,用镊子小心取出膜,样品面向上,放置于干燥的滤纸上,轻轻吹掉表面比较明显的液体。立即进入交联(步骤(2))步骤。
注:
a. 转膜时间建议在30-60 min,如胶比较厚则应当适当延长转膜时间;
b. 结合膜的表面一定不能干燥!
c. 采用半干转膜仪建议按照390mA,30min。
(2) 交联
a. 利用紫外交联时建议交联条件为:120 mJ/cm²,选择紫外波长254nm,45-60s。
如无紫外交联仪可以使用普通的手提紫外灯进行交联,在距离膜3-375px的位置照3-15min,最佳交联条件需要根据标准品咨询过摸索;
b. 交联完成后进行检测,也可用保鲜膜包裹膜后置于室温干燥条件存放,可存放3-5天再进行检测。
(3) 封闭与孵育抗体
a. 封闭:取封闭液 (P1203) 15ml,加入适当容器中(如抗体孵育盒),再加入交联后的尼龙膜或者PVDF膜 室温摇育 15min。
注:确保封闭液是完quan溶解的状态再使用。
b. 取7.5ul Streptavidin-HRP稀释于15ml 封闭液(按照1:2000稀释),将封闭后的膜加入封闭液中,置于摇床(水平或者侧摆皆可)室温孵育15 min。
注:Streptavidin-HRP稀释液可以重复使用3-4次,建议保存于-20℃,1月内使用完。
c. 洗涤:将5X 洗涤液25ml用蒸馏水或者milli Q稀释至 1X (稀释后体积25ml),取稀释后的洗涤液20ml洗膜,洗膜4 次(每次 5 min)。
d. 将膜转至含有20-25ml 检测平衡液的孵育盒中,在摇床上缓慢摇动5 min。
(4) ECL 显色
a. 取ECL发光液A液和B液各5ml按 1:1 混合 ECL A/B 液制成发光工作液。
注:发光液必须现用现配。
b. 将检测平衡液中的膜取出用吸水纸吸掉过多液体,置于保鲜膜或者干净的容器内,在膜表面添加发光工作液至覆盖全部的膜,室温静置2-3 min;
c. 将膜放于2片保鲜膜或者其他适当透光薄膜中间病故定于压片暗盒内部,用X光胶片压片1-5 min,显影定影,或者直接用化学发光图像分析系统中扫描成像。
三、注意事项
1、探针设计时要确保探针包含蛋白结合位点,长度建议 20-40 bp。
2、本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗。
3、为了您的安全和健康,请佩戴一次性手套进行操作。