植物免疫沉淀试剂盒应用介绍

更新时间：2025-06-18

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　　植物免疫沉淀试剂盒是用于研究植物体内蛋白质相互作用或蛋白质-DNA相互作用的重要工具，应用介绍：

　　研究蛋白质相互作用：如确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用，可用于磷酸化位点分析、激酶活性分析、乙酰化位点发现与鉴定等研究分析。

　　研究蛋白质-DNA相互作用：用于葡萄转录因子VlbZIP30抗旱功能及其调控机理研究等。从葡萄品种中克隆到VlbZIP30，并通过遗传转化模式植物，研究VlbZIP30对干旱胁迫响应的功能及其调控机制。EMSA、双荧光素酶活性分析和染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR实验结果表明，VlbZIP30可以直接特异性结合木质素生物合成基因和干旱响应基因启动子上的G-box顺式作用元件，以激活其表达，最终赋予转基因葡萄的抗旱性。

　　操作流程(以植物染色质免疫沉淀分析试剂盒为例)

　　准备溶液：如90%乙醇、70%乙醇、37%甲醛、2M甘氨酸溶液、14.3M β-巯基乙醇、1X TE缓冲液(pH 8.0)等(不提供，可单买)，并确保所有的缓冲液是清澈的。

　　抗体结合在微孔板中

　　预估实验所需联管的数量，小心确保从板架上移走不需要的联管并把他们放回袋子(轻轻合上袋子并储存在4°C)。使用150 μl 的CP1清洗孔一次。

　　每孔添加100 μl的CP2，并依次加入如下抗体：加1 μl的Normal-Mouse IgG作为阴性对照和加1 μl的Anti-Dimethyl H3-K9作为阳性对照，并添加2 - 3 μg自己感兴趣的抗体到样本孔。

　　使用保鲜膜(封板膜或石蜡封口膜)紧紧密封条板，避免蒸发并在室温孵育60 - 90分钟。孵育完后，移走孵育过的抗体溶液并吸取150 μl的CP2用移液器来回清洗孔三遍。同时，从细胞中制备DNA片段。

　　收集组织和在活的有机体内交联(以单层或附着细胞为例)

　　从生长在土壤中或在50 ml的试管内，收集0.8 - 1g的植物组织(花，叶片和幼种)。

　　使用20ml的去离子水轻柔地冲洗组织两遍。

　　在圆锥管(被甲醛浸泡的组织)的顶端填满50 ml并使用尼龙纱布保证组织的渗入在真空渗入(并有利于清洗步骤)的过程中。另外，需要使用类似缝衣针的工具在圆锥管盖上扎些孔，然后将盖子盖上。

　　在真空泵的附件上，干燥器上真空渗入组织10分钟。甲醛溶液应该煮沸。

　　组织裂解和基因组DNA剪切

　　添加1.25ml 2M的甘氨酸溶液(终浓度是0.125 M)熄灭交联并继续使用真空渗入持续5分钟。

　　移走甲醛并使用20 ml的去离子水冲洗组织两遍。在漂洗后，尽最大可能移走水。在这个实验阶段，交联好的组织要么在液氮中冷冻保存或–80°C储存，要么直接用来进行核染色质的提取。

　　以1:5的比例(1X CP3C)，使用蒸馏水稀释CP3C。添加3.5ul的BME到每10ml的1X CP3C。使用液氮研磨组织成精细粉末。将粉末放入装有20 ml 1X CP3C的50ml的圆锥管中，然后涡旋并放在冰上。

　　过滤液通过二层的米拉布流入到50ml的管子中并以转速4000 rpm(1900X g)离心过滤液20分钟。

　　添加1ul BME到每1ml的CP3D中。移走上清液并在包含BME的1ml CP3D再次悬浮小球。转移再次悬浮的小球到一个1.5 ml的管子中并在4°C转速12,000 rpm持续离心10分钟直至有核产物出现(在这个阶段可以看到有白色的小球)。

　　添加1ul BME到每1ml的CP3E中。移走上清液并在包含BME的300 ul CP3E再次悬浮小球。

　　添加包含BME的300 ul CP3E到一个新的1.5 ml的管子中。从第6步中300 ul的缓冲液顶端将小球重悬并在4°C转速14,000 rpm持续离心45分钟。

　　移走上清液并在包含Protease Inhibitor Cocktail(PIC)(如：每1ml的CP3F添加10ul的PIC)的500 ul CP3F再次重悬染色质。通过声处理设备剪切DNA。例如：在冰上对染色质溶液进行超声理五次，每次在工作周期的40%的时候，15秒；将布兰森超声设备的功率设置在2。在每次超声波处理中，需将样本放置在冰上1分钟。若有必要，取5ul声处理过的细胞裂解物进行琼脂糖凝胶电泳分析。剪切的DNA大小应该是在200 - 1000 bp。

　　在4°C，转速14,000 rpm，离心细胞碎片小球10分钟。

　　蛋白/DNA免疫沉淀

　　转移清澈的上清液到一个新的1.5ml的离心管。(在这一步，上清液需储存在–80°C)按照所需以1:1的比例使用CP4稀释上清液(如：添加100 μl的CP4到100 μl的上清液)。

　　转移5 μl稀释的上清液到0.5ml瓶中。

　　转移100 μl稀释的上清到每个包被抗体的孔中。使用保鲜膜(封口膜或石蜡封口膜)紧紧密封条板，避免蒸发并在摇床(50 - 100 rpm)上室温(22 - 25°C)孵育60 - 90分钟。

　　转移上清液。使用150 μl的CP1清洗孔六次。允许在摇床(100 rpm)上进行2分钟的清洗。每次使用150 μl的1X TE缓冲液清洗孔(2分钟)。

　　交联DNA反转/纯化

　　添加1μl的蛋白酶K到每40 μl的CP5中并混合。添加40μl包含蛋白酶K的CP5到样本孔(包含“输入DNA”瓶)。使用保鲜膜(胶套膜或石蜡封口膜)紧紧密封条板，避免蒸发并在水浴下65°C水育15分钟。

　　添加40 μl的CP6到样本孔中，混合，使用保鲜膜(胶套膜或石蜡封口膜)紧紧密封条板，避免蒸发并在水浴下65°C孵育90分钟。同样，添加40μl包含上清液，标有“输入DNA”的CP6到瓶中。

　　将离心柱放置在2ml的离心管中。添加150 μl的CP7到样本中并将混合液转移到柱子中。

　　添加200 μl的70%的乙醇到柱子中，以12000rpm离心15秒。

　　将柱子放置在一个新的收集管中。添加200 μl的90%的乙醇到柱子中，以12000rpm离心20秒。

　　从收集管转移柱子并弃废液。将柱子放置在一个新的收集管中。再次添加200 μl的90%的乙醇到柱子中，以12000rpm离心35秒。

　　放置柱子到新的1.5 ml瓶中。直接添加10 - 20 μl的CP8到柱基质中并以12000rpm全速离心20秒来洗脱纯化的DNA。现在DNA可以使用了，或在 - 20°C储存。

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