无缝克隆试剂盒的使用流程

更新时间：2025-08-15

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　　无缝克隆试剂盒基于同源重组原理，通过插入片段与线性化载体末端的同源序列(15-25 bp)实现定向重组，无需酶切与连接步骤，具有操作便捷、阳性率高(可达95%以上)、支持多片段重组等优势。

　　无缝克隆试剂盒其使用流程可分为以下三个核心步骤：

　　一、线性化载体制备

　　酶切法

　　双酶切：选择载体中两个不同的酶切位点，用限制性内切酶消化载体，通过凝胶电泳分离并回收线性化载体。双酶切可降低载体自连背景，提高阳性率。

　　单酶切：若无可选双酶切位点，可采用单酶切，但需延长酶切时间(2小时至过夜)并进行脱磷处理(如CIP处理20分钟)，以减少自连假阳性。

　　注意事项：酶切后需通过胶回收纯化线性化载体，避免环状质粒残留；若载体长度超过10 kb，建议延长酶切时间以确保线性化。

　　反向PCR法

　　在载体克隆位点两侧设计一对反向引物，通过PCR扩增获取线性化载体片段。

　　关键点：使用高保真DNA聚合酶(如Phusion或Q5)扩增，避免碱基突变；扩增产物需通过胶回收纯化，去除环状模板质粒。

　　二、插入片段制备

　　引物设计

　　在插入片段的正反向引物5’端引入与线性化载体末端一致的同源序列(15-25 bp)。

　　示例：

　　正向引物：5’-上游载体同源序列(15-25 bp)+插入片段特异性序列-3’

　　反向引物：5’-下游载体同源序列(15-25 bp)+插入片段特异性序列-3’

　　注意事项：

　　同源序列Tm值需≥48℃，可通过公式计算(A-T碱基对=2°C，G-C碱基对=4°C)。

　　若载体为粘性末端且3’端突出，引物设计需包含突出部分；若5’端突出，则可选择性包含。

　　避免在同源序列中引入酶切位点，除非需保留重组后位点。

　　PCR扩增

　　使用高保真DNA聚合酶扩增插入片段，扩增产物需通过凝胶电泳分离并回收。

　　特殊情况处理：若扩增模板为环状质粒，建议用Dpn I消化模板DNA，避免残留质粒干扰重组反应。

　　三、重组反应与转化

　　重组反应体系配制

　　推荐比例：

　　线性化载体用量(ng)= 0.02 × 载体碱基对数(如5 kb载体需100 ng)。

　　插入片段用量(ng)= 0.04 × 片段碱基对数(单片段)或 0.02 × 片段碱基对数(多片段)。

　　若插入片段长度小于200 bp，需使用5倍载体用量。

　　反应条件：将线性化载体、插入片段与2× Cloning Master Mix混合后，50℃孵育15-60分钟(片段数量与长度影响反应时间，如2-3个片段反应20分钟，4-6个片段反应60分钟)。

　　转化与筛选

　　热激转化：

　　取100 μL冰浴融化的感受态细胞(如DH5α)，加入5-10 μL重组产物，轻轻混匀后冰浴30分钟。

　　42℃水浴热激45-90秒，迅速转移至冰浴中静置2分钟。

　　加入500 μL无抗生素LB培养基，37℃、200 rpm复苏1小时。

　　涂布平板：取100-300 μL复苏液均匀涂布于含相应抗生素的LB平板，37℃倒置培养过夜。

　　阳性克隆鉴定：

　　菌落PCR：用枪头挑取单菌落至10 μL无菌水中混匀，取1 μL为模板进行PCR扩增(建议使用载体通用引物或特异性引物)。

　　酶切鉴定：提取质粒后用相应内切酶酶切，电泳检测片段大小。

　　测序验证：对阳性克隆进行测序，确认插入片段序列正确性。