脂溶性Cy5.5
菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最gao的，其琥珀酰亚胺 酯是最chang用的脂 肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。

CyDye mono-reactive NHS Esters (菁染料琥珀酰亚胺酯)

1.产品简介：

   菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最gao的，其琥珀酰亚胺 酯是最chang用的脂 肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。 通过改变次甲基链的长度，可改 变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照Huoffman 规则正 好红移约 100nm。 菁染料 Cy3 和 Cy5 已成为基因芯片的首xuan荧光标记物；另外,Cy5, Cy5.5 和 Cy7 的吸收在近红外区背 景非常 低，是荧光强度最gao、最wen定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。但 由于菁染 料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。菁染料 特别是水溶性菁 染料分子极性大，分离提纯越加困难。

 表 1.菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数

2. 操作步骤

2.1水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体

市场上买到的抗体如果含有其它蛋白(例如serum albumin或gelatin等)或带氨基的缓冲液会影响标记, 在标记前需纯化。

1.在1 L 0.15 M NaCI溶液中透析anti-GST抗体(浓度为0.5 mL at 3 mg/mL),常温透析4小时。

2.在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCI溶液再透析过夜。

3.第二天用1 L 0.1 M NaHCOs (pH 8.3)透析4小时。

4.用0.22卩m注射器过滤头过滤抗体溶液。

5.用0.1 M NaHCOs稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量(IgG antibody摩尔吸光系数170 000 cm" at 280 nm).

6.用DMS。配置Cy3 NHS(MW 765.95)溶液浓度为10 mg/mL；计算所需体积以得到想要的CyDye NHS和抗体的比值(例如20:1),然后慢慢'寿其入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅 拌 45 分钟。

7.用1 L 0.15 M NaCI 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。

8.在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCI溶液再避光透析过夜。

9.用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01%叠氮hua钠溶液常温避光透析4小时，在4°C常温避光再次透析过夜。

10.用0.22卩m注射器过滤头过滤抗体溶液。

11.用0.01 M PBS/0.01 %叠氮hua钠整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm (蛋白)和552nm (Cy)处的紫外可见吸光度。

12,产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01%叠氮hua钠溶液中，-20°C避光储存。

2.2 水溶性 Cy5 NHS 标记

1.Cy5 NHS 1.0 mg溶解于400 pL DMS。后，加入到1mL的玻璃瓶中盛有(D-seQ-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg)的400 pL DMS。溶液。(Dye和peptide投料比是1:1)

2.然后加入15卩L三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。

3.用HPLC纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25cmx10mm),每次上样注入2x400卩L, 30分钟梯度洗脱从0.1% TFA水溶液到MeCN：HQ (0.1% TFA) =70：30,流速4mL/min°(对不同的蛋白选择不同的合适HPL C梯度流动相)

4.收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。

5.产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20°C避光储存；必要肘可用质谱表征。

6.CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4 ℃可避光保存2月；更长期的保存需加入等体积的甘油-20 °C避光保存。

2.3 水溶性 CyDye SE 标记

         氨基封端的OLIGO可以标记CyDyeSE,但是非常困难；标记前因为OILGO经氨水脱保护， 请务必洗涤掉 所有的残余氨水。然后将样品真空干燥；然后溶于0.25 ml的0.5 M NaCI溶液中，用Sephadex G-50 脱 盐，用5.0 mM borate缓冲液平衡到pH=8.0,然后用以上硼酸缓冲液 冲下 OLIGO。然后浓缩至干的样品溶于0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸缓冲液中30 nmoles的。LIGO加入到CyDye SE的玻璃 瓶中室温避光，密闭搅拌反应60min。 反应物经Sephadex G-50或RP-HPLC过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides 和 oligopeptides 由于太小会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜，无法标记。

2.4 活体成像领域

SPF级BALB/C裸鼠，6-8周龄，18-20克，实验前24 h自由进食、饮水。

于实验裸鼠腹腔内注射2%戊babi妥钠300^(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活 体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物DMSO稀释后，于裸鼠尾静脉注射200pL( 0.5 mg/g)［最jia用量和时间需要客户根据自己的仪器和药 物试剂等条件优化］，每5min记录1张动物 在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分 布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速 解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾 等脏器，进行成像。

 Cy7 检测时激发波长700〜770 nm带通，发射波长790 nm长通。液晶可调谐滤光片扫描 范围780〜950 nm，扫描步进 10 nm。曝光时间为500 ms。

不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐歩向膀胱聚集， 呈现显著的肾 排泄的特点一般 4~6 小时，快得只有30分钟；如果是骨骼等部位靶寻的Cy7标 记药物，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。

器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醪也不4小时以上，0%, 20%, 30%PBS蔗糖依次沉底,20卩m切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，B応干，DAP'染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氨氤633 nm。

稳定性与储存：

  未幵封的粉末在避光干燥-20°C存放12月。CyDye NHS水溶液现配现用不能储存。任何溶解后的CyDye NHS粉末最hao立即使用；无水h；DMSO瞥/- 20°C保存最duo2个星期。

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