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更新时间：2025-09-19
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WB 实验即蛋白质印迹法，是分子生物学、生物化学等领域常用的实验技术。它依据抗原抗体的特异性结合原理，能对样品中的特定蛋白质进行定性或半定量分析。WB 实验凭借高特异性和灵敏度，在蛋白质表达水平研究、蛋白质分子大小鉴定、疾病标志物检测等方面发挥着重要作用，是生命科学研究中不ke或缺的有力工具。
实验原理
WB实验基于抗原-抗体的特异性结合反应，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，将其转移至固相载体(如PVDF膜)，再利用特异性一抗和酶标记二抗进行检测，最终通过化学发光或显色反应实现目标蛋白的定性、定位及半定量分析。
实验步骤
一、样本制备
1.样本收集
①贴壁细胞收集：吸出培养基，向培养皿中加入预冷的1×PBS，漂洗2次，利用细胞刮或胰酶消化收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，离心收集细胞沉淀。
②悬浮细胞收集：先离心收集细胞沉淀，再用预冷 PBS 轻轻吹打重悬，然后离心收集细胞沉淀。
③动物组织样本收集：在冰上用干净的医用剪将组织剪成小块。然后在液氮中将组织研磨粉碎。
④植物样本收集：取适量植物组织样本（叶片等）放置于冷冻液氮中，之后将冷冻后的植物组织放于研钵进行研磨，尽可能充分研磨破坏其细胞壁。
2.总蛋白提取
①细胞/组织裂解：
细胞样本，加入预冷的裂解缓冲液(含有 PMSF/蛋白酶抑制剂)，冰上裂解 15min。
组织样本，按照 1mL 裂解液/100mg 组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，多次匀浆，直至组织完quan匀浆，收集匀浆液。
②把裂解好的样本12000rpm离心10min，取上清用于后续实验。
③蛋白变性：
吸取 10μl 蛋白上清做蛋白浓度（BCA 法）测定。向剩余的蛋白提取液中加 5× Loading Buffer（最终工作液为 1x)，95℃加热变性 10min，待液体完quan冷却后置于-20℃分装保存，避免反复冻融。
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二、蛋白浓度测定
1.BCA法
测定原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
特点：灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小，不受去垢剂的影响。
2.Bradford法
测定原理：在酸性条件下考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue G-250)与蛋白质结合后，染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，形成的复合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可以在595 nm波长下测定吸光度值从而计算蛋白含量。
特点：操作简单，对EDTA、EGTA等还原剂兼容性好，但易受强碱性和高浓度去污剂影响。
3.Lowry法
测定原理：碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
特点：不受脂类物质干扰，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。
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三、凝胶电泳
1.制胶
①取干净的胶板，用水冲洗后，擦拭干净，对齐插入板夹中。
②检漏:加入水检查是否漏水(20min)，将水倒掉，用吸水纸吸干净。
③配分离胶：取干净的空烧杯，按照下层胶配比(分离胶)依次加入、混匀。加TEMED之后混合均匀，迅速加入两板之间，液体加至距短板上约2cm处停止加液。用异丙醇进行液封，室温放置待下层胶凝固(20min)，倒掉上层液体，吸水纸吸干水。
④配浓缩胶：按比例配制浓缩胶，加速混匀，迅速加入两板之间。插入梳子，室温放置，待上层胶凝固(20min)。从固定台上取下夹板，打开夹子。
注：除了添加各种试剂手工配胶，目前还有制胶试剂盒和预制胶的两种更加方便快速的制胶方法。
浓缩胶浓度选择：
2.跑胶
①将胶板上的梳子拔出后，在流水中轻柔冲洗上样孔，将碎胶冲出孔外。
②将胶板组装在电泳仪器上，注意短的玻璃板朝电泳槽内放置，要对齐夹紧不能漏液。
③加入电泳液，内槽必须加满电泳缓冲液，外槽可以不加满。
注：注意观察内槽是否漏液，若漏液的话需要重新装板。
④按照方案将蛋白和marker加入上样孔中，目的蛋白每孔上样量20μg-40μg，内参蛋白每孔上样量5μg-10μg。marker的用量参考试剂说明书。
⑤盖上盖子，注意不要弄错方向，连接电源；浓缩胶设置恒压80V，跑胶30min左右，然后设置分离胶恒压120V，至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。
注：不同的胶跑胶时间可能会有区别，主要以第一次实验建议多观察几次，记录跑胶所需要的时间。
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四、转膜
1. 将PVDF膜浸泡在甲醇中激活30s。
注：PVDF膜有0.22μm和0.45μm两种规格的，20KD以下蛋白建议选用0.22μm的，20KD以上蛋白建议选用0.45μm的。
2. 电泳结束后将胶板取出，短玻璃板朝上放置，揭开短玻璃板后切除多余的胶，在水中将胶从长玻璃板上取下。
3. 在电转液中，转膜夹黑色面朝下，依次放置海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵（三明治结构），夹紧转膜夹，PVDF膜要与胶贴合，排走气泡。调整转膜夹黑色界面转向转膜槽负极，白色面朝向转膜槽正极。灌满转膜液后，用200-400mA恒定电流转膜，转膜要在冰浴中进行。
注：转膜的时间和蛋白大小、电流大小及转膜液的类型有关。
转膜条件选择：
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五、封闭
1. 将膜取出后，应观察到marker完quan从胶转移至膜上。
2. 用TBST清洗掉膜上残留的转膜液，每次5-10分钟，洗3-5次。
3. 将PVDF膜浸泡在5% 脱脂牛奶中，缓慢摇荡，室温孵育1h。
注：除脱脂牛奶，封闭也可以用BSA或者商品化的封闭液。
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六、抗体孵育
1. 孵育一抗：封闭结束后，用1xTBST缓冲液洗掉多余封闭液，洗膜每次5-10min，共3-5次。一抗使用一抗稀释液或TBST按照抗体说明书建议的比例稀释(具体条件自行摸索)使用，然后将膜浸泡在一抗中，于4℃冰箱中摇床孵育过夜，一抗孵育后可以回收。
2. 孵育二抗：用1xTBST缓冲液洗掉多余一抗，洗膜每次5-10min，洗3-5次。使用5%脱脂牛奶或商品化抗体稀释液按照说明书推荐比例稀释二抗，室温慢摇1h。
3. 洗膜：二抗孵育完毕后，回收二抗，用1xTBST洗膜，每次5-10min，洗3-5次。
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七、曝光
1. 配置显影液(A液:B液=1:1)，避光。
2. 显影液滴于PVDF膜上，孵育1-3min。
3. 孵育结束后，垂直吸取多余发光液，蛋白面朝上置于仪器中，可裁剪锡箔纸遮光。
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