IP/COIP实验-基础篇

在分子生物学和蛋白质研究中，免疫共沉淀 (Co-IP)和免疫沉淀 (IP)实验是探索蛋白 质相互作用、验证靶蛋白结合关系的关键技术。无论是研究信号通路、蛋白复合物，还是疾病相关蛋白网络，IP/Co-IP 都能提供直接的实验证据，帮助科学家深入解析生命活动的分子机制。本期内容将系统梳理IP/Co-IP 实验的详细步骤以及如何分析实验结果。

一、实验原理

免疫沉淀/免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质的方法。 在免疫沉淀中，通过特定抗体与目标蛋白结合，形成抗体—抗原复合物，再利用沉淀的方法将其 从混合物中分离出来，从而纯化目标蛋白。而免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用。当用预先固化在beads上的蛋白质A 的抗体免疫沉淀A 蛋白，那么与A 蛋白在体内结合的蛋白质B 也能一起沉淀下来。

①用proteinA/G连接抗体，然后用抗体去抓目的蛋白

②beads上已经偶联了标签抗体，可以直接抓目的蛋白

二、实验流程

样品制备

植物样本：分成小块后用液氮研磨粉碎，然后加入裂解液(加蛋白酶抑制剂)冰上/借助超声裂解合适 的时间，离心取上清。

动物细胞：弃去培养基，用PBS 洗几次，然后加入裂解液(加蛋白酶抑制剂)冰上裂解合适的时间， 离心取上清。

动物组织：剪碎后加入裂解液(加蛋白酶抑制剂),然后用匀浆器匀浆，裂解充分后离心取上清。

平衡beads

用TBS 等缓冲液或者裂解液清洗beads3-5 次，将beads 中的保护液替换成实验中缓冲液体系，避免影 响下游实验。

孵育

方法一：抗体和磁珠先孵育

选择经过IP验证的抗体，可以减少失败的可能性，此外抗体的用量也较为重要，抗体用量过少不 利于后续抗原结合，而抗体过多就不能完quan吸附在beads 上，造成浪费，一般建议抗体使量为 2-5ug  即可。抗体和beads 室温孵育30-60min 或4℃孵育1-2h后，吸弃上清，加入裂解后的样品共孵育。

注：若使用已经偶联好标签抗体的beads，则可以直接和裂解好的样品孵育，不用偶联抗体。

方法二：抗体和抗原先孵育

抗体和抗原先进行孵育，然后抗体抗原复合物与beads进行孵育。

洗杂

用裂解液或PBS 洗涤沉淀，2500rpm (约1000g)离心5min, 或瞬时高速离心，小心吸除上清，重复此 步骤3-5次。这一步是为了洗去未结合的杂蛋白。