IP/CO-IP常见问题

IP/COIP常见问题

1、设置实验对照

阳性对照：input, 即裂解后的上清，判断目的蛋白是否表达。

阴性对照：和ip抗体同型的IgG。

2、抗体、样本、beads的加入顺序

①抗体先与蛋白结合，再加入beads;

②抗体先与beads 孵育，最后加入蛋白；

③ 抗体、样本和beads 同时加入。

一般情况下①和②相差不大，如果蛋白量过高，比如大于1000ug,建议 使用第二种，否则蛋白容易吸附在磁珠上，降低得率。

3、beads磁珠和琼脂糖珠如何选择

琼脂糖珠：需要离心，操作繁琐；吸走上清时容易吸走样品。

磁珠：无需离心，缩短操作时间；磁珠吸到管壁，不易被吸走样。

4、如何避免轻重链污染

产生轻重链的原因：在变性洗脱过程中，抗体在高温和还原剂的影响 下分解为重链55KD 和轻链25KD, 当WB 所用的抗体和IP抗体同源时，二抗就会识别到IP抗体的轻重链。

避免方法：

①IP抗体和WB 一抗选用不同来源的。

②二抗采用Fc抗体或者Fab 抗体避开轻链或重链。

③选择偶联纳米抗体的beads。

5、input组有条带 ，IP组无条带

①确定使用的抗体是否可以用来做IP,尽量选择可以做IP的抗体。

②IP抗体加入的量少， IP抗体特异性差，或者蛋白量过高，优先覆盖 住beads,  导 致IP抗体和beads 的结合较少等，可以优先通过增加抗 体用量和优化结合顺序改善，实在没有改善只能更换抗体进行尝试。

6、input组没有条带 ，IP组有条带

input 组没有条带可能是因为蛋白表达量较低，而IP组经过富集后蛋 白含量较高，所以可以检测到。可以提高input 组的上样量或者在提 蛋白时提高样本量。

7、IgG 组及IP 组均检测到目的条带

原因：

①检测蛋白与beads 有非特异性结合。

②洗涤不充分，有残留蛋白。

 解决办法：

①使用封闭剂(如5%BSA)  预处理磁珠。

②增加洗涤次数或提高洗杂液的盐浓度。