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产品简介
| 品牌 | LABLEAD | 货号 | P0243 |
|---|---|---|---|
| 供货周期 | 一周 | 应用领域 | 生物产业 |
货号：P0243
存储条件：-80℃，1年有效
干冰运输。开封后，将无细胞蛋白表达反应组分置于-80℃储存。为避免反复冻融，可根据反应用量，将A液和B液分别分装后用液氮速冻后再置于-80℃储存。
产品组分
组分 | 20 rxns | 100 rxns |
Cell-free system solution A Max | 300 μl | 1.5 ml |
Cell-free system solution B | 600 μl | 3 ml |
CFPS-Control Plasmid | 2 μg | 2 μg |
产品说明
无细胞蛋白合成试剂盒（Cell-Free Protein Synthesis Kit）是一款基于大肠杆菌细胞裂解液进行体外蛋白质合成的产品。该产品利用细胞裂解液中的核糖体、翻译因子、酶等活性物质，同时补加能量、核苷酸、氨基酸、无机盐等，在体外重构转录-翻译体系。以DNA或RNA为模板，表达出蛋白质。无细胞蛋白表达是一种不依赖于活菌，能够快速、灵活地大量表达蛋白质，和传统的重组表达体系相比有众多的优势：
1. 蛋白表达快，1~2 h即可表达出目的蛋白，8~24 h即可达到最大量。
2. 蛋白表达量高，最gao可达到3 mg/ml以上的蛋白。
3. 反应简单灵活，仅需向反应体系中加入DNA或RNA模板，可使用96孔板或离心管进行反应。
注：本货号产品可表达常规蛋白，更适用于表达含二硫键的蛋白。
适用范围
产品jin限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
操作说明
1. 基因构建
目的基因的构建对于蛋白表达至关重要，推荐使用下图的构建方式。可以将目的基因构建到本试剂盒附带的阳性质粒上（质粒图谱详见外包装标签扫描二维码内文件），即如下的构建方式；也兼容pET9a、pET-23a 等含有T7启动子，但不含乳糖操纵子（lac）的PET系列质粒。
注：含有lac乳糖操纵子的质粒（如pET28a等）会对产量有较大影响，不建议直接使用。
阳性质粒的DNA序列示意图如下所示：
2. 模板制备
无细胞蛋白合成试剂盒可以使用DNA或mRNA作为模板表达重组蛋白。采用的DNA模板可以是质粒，可以是PCR产物，也可以是使用 phi29 进行RCA滚环扩增的产物。
2.1 质粒：通过基因公司合成，或亚克隆获得适用于无细胞反应的质粒，并采用柱纯化方式提取质粒；
2.2 PCR产物：设计引物，正向引物在T7启动子上游200 bp左右，反向引物在终止密码子下游200 bp左右（包含T7 terminator），对模板进 行扩增，获得的DNA线性片段可以不经纯化直接投入到无细胞反应体系中。上下游200 bp碱基的作用是保护DNA线性片段不被内源性外切酶降解。
2.3 RCA产物：使用phi29聚合酶、随机六引物进行滚环扩增RCA，获得的DNA产物可直接用于无细胞反应体系中。
2.4 PCR和RCA可以和Golden Gate以及Gibson Assembly联用，将极大提高DNA模板制备的速度和通量。
2.5 DNA模板使用前需要准确定量；建议使用高质量的质粒提取试剂盒进行质粒提取，避免引入RNase A；基因合成公司返回的质粒需强调使用柱纯化方式，否则不能直接用于无细胞反应。
3. 无细胞蛋白表达
3.1 根据反应体系总量计算所需的A液和B液（体积比1:2），将所用的试剂于冰上添加到反应容器中（例如2 ml圆底离心管），并混匀。操作过程需全程佩戴手套、口罩，并采用无酶源的移液器吸头和反应容器，避免引入核酸酶。
无细胞反应体系可参照下表进行混合配制：
组分 | 终浓度 | 50 μl 体系 | 100 μl 体系 |
Cell-free system solution A Max | 30% | 15 μl | 30 μl |
Cell-free system solution B | 60% | 30 μl | 60 μl |
模板 | 5~10 μg/ml | ||
无核酸酶水 | / | Up to 50 μl | Up to 100 μl |
3.2 向反应体系中加入模板 DNA，推荐 DNA 模板的添加终浓度为 5~10 μg/ml，可对DNA 模板添加量进行优化。
3.3 将反应容器放置到普通摇床或恒温混匀仪中，进行无细胞蛋白表达，推荐反应温度为25~30℃。降低温度会降低蛋白的合成速率，但会增加蛋白的可溶性。一般反应8 h左右即可达到最da的蛋白产量，也可以过夜反应16 h。当反应温度降低时，应适当增加反应时间。
3.4 无细胞蛋白表达需要充足氧气，当使用2 ml圆底离心管作为反应容器时，反应体系不超过100 μl。无细胞蛋白反应可以等比例放大，放大的反应体系需要使用更大的反应容器，例如摇瓶等，同时保证摇床的转速（200 rpm）。
4. 检测
反应结束，取反应液（检测全部蛋白）或反应上清（检测可溶蛋白）1 μl左右，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测目的蛋白的表达。
5. 阳性对照
本试剂盒中有绿色荧光蛋白sf-GFP质粒作为阳性对照，可通过肉眼直接观测反应结果。sf-GFP成功表达后，无细胞反应体系将呈现明显的绿色。
如需对sf-GFP进行精确定量，可使用酶标仪进行检测（Ex/Em=485/528 nm）。
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